Gélelektroforézis (DNS elemzés)
A gyakorlat programja (1x10x4):
|
Időtartam (óra)
|
Tevékenység
|
|
0.5
|
ZH
|
|
0.5
|
bevezető, eszközök, feladatok ismertetése
|
|
1
|
mintaelőkészítés, gél elkészítése
|
|
1.5
|
mérés, a gél fotózása
|
|
1.5
|
kiértékelés, diszkusszió, jegyzőkönyv elkészítése egyénileg (otthon)
|
|
5
|
|
-
A gyakorlatvezető bemutatja a módszer elvét, a készülék felépítését, a kiértékelő szoftver működését.
-
A gyakorlaton DNS fragmenteket (DNS létra standard) határoznak meg agarózgél elektroforézis módszerrel. 1 csoport 1 gélt készít, melyre minden hallgató 1-2 mintát visz fel. Az ismeretlen mintákat (összesen 2) úgy készítjük, hogy 4 µL mintapufferhez (loading dye) 1 µL ismeretlen törzsoldatot mérünk. Minden mintát (DNS létrák és ismeretlen) kétszer viszünk fel a gélre két különböző mintatartó zsebbe. A mintatartó zsebekbe 2 µL mintát kell a mikropipettával bejuttatni. Az elektroforetizáló kád összeszerelése után a gyakorlatvezető segítségével történik a tápegység beállítása és bekapcsolása. Az elektroforézis várhatóan kb. 1 órát vesz igénybe.
-
20 perc-es ZH.
-
Elválasztást követően a DNS-t Dark Reader készülékkel teszik láthatóvá, a gélt lefényképezik.
-
A gyakorlatvezető útmutatásai szerint a hallgatók önállóan értékelik ki a gyakorlaton kapott eredményeket.
AMENNYIBEN TÖBBEN UGYANAZT AZ ADATKIÉRTÉKELÉST ADNÁK BE, A LEGJOBB JEGY AMIT A GYAKORLATON ŐK KAPHATNAK: 2.
A gél lefényképezésekor kapott jpg fájlt szoftveresen kell kiértékelni (a CP-ATLAS gélkiértékelő szoftver letölthető, a használati útmutató itt található. Downloads menüpont, CpAtlas.zip vagy CpAtlas.rar fájl, kicsomagolás után telepítés nélkül futtatható).
-
Az eredmények értékelésénél az ismeretlen DNS fragmens bázispár számának meghatározásához szerkesszen kalibrációs egyenest Excel programban (bázispárok számának (végsősoron a molekulatömeg) logaritmusa a migrációs távolságok (Rf értékek) függvényében ábrázolva). A diagramon az egyenes egyenletét és az R2 értékét is tüntesse fel. A kapott diagramot ragassza be a jegyzőkönyvébe! A jegyzőkönyvhöz csatolja a gél fényképét (kis méretben!), a kiértékelő szoftverrel készített elektroferogramokat illetve az ezekből nyert adatokat táblázatos formában (pl. print screen módszerrel). Lefényképezheti az elektroforetizáló berendezést, beragaszthatja a jegyzőkönyvébe és elláthatja jelölésekkel, megjegyzésekkel.
-
A kapott eredményeket, megfigyeléseket megfelelően dokumentálja és értelmezze is azokat. Figyelje meg az elektródoknál tapasztalható gázfejlődés intenzitását, a megfelelő reakciók felírásával magyarázza meg a tapasztaltakat. Diszkutálja, hogy az Rf értékek milyen összefüggésben vannak a DNS fragmensek bázispárjainak számával. Mivel magyarázható, hogy DNS fragmenseket agarózgélen, míg fehérjéket poliakrilamid-gélen választanak el egymástól? Az agarózgél koncentrációjának változtatása hogyan befolyásolja a (kisebb és nagyobb) DNS fragmensek elválasztását? A különböző koncentrációjú DNS létra minták esetén vizsgálja meg, hogy a csúcs alatti területek és a koncentrációk között megállapítható-e hozzávetőleges lineáris összefüggés.
A gyakorlatra való felkészülés során kérjük nézze meg az „Agarózgél készítése”, a „Gélelektroforézis lépései” és a „Mikropipetták használata” című videókat.
A jegyzőkönyveket a D szárny 5. emelet folyosó végén lévő „Gélelektroforézis” feliratú polcra kell berakni.
Lehetséges feladatok, kérdések a ZH-ban:
-
Az elektroforézis 3 alapvető módszere.
-
Hogyan készítik az agarózgéleket DNS elemzéshez?
-
Hogyan készítik a poliakrilamid-géleket? Milyen elrendezésekben alkalmazhatók?
-
Ismertesse részletesen a diszk PAGE módszert.
-
Az SDS-PAGE eljárás elve és alkalmazási köre.
-
Milyen hatása van a hőmérsékletnek, pH-nak, ionerősségnek, térerőnek a gélelektroforetikus elválasztásra?
-
Hogyan történik a fehérjék és nukleinsavak detektálása az elektroforetikus elválasztást követően?
-
Blottolási eljárások főbb jellemzői.
-
Nagyhatékonyságú DNS szekvenálási módszerek.
Ajánlott irodalom:
-
-
C.D. Harris: Quantitative Chemical Analysis, 7. kiadás, Freeman, 2007
-
G.D.Christian: Analytical Chemistry, 6. kiadás, Wiley, 2004
-
Gáspár A.: Kapilláris zónaelektroforézis, Egyetemi Kiadó, 2000
-
Wikipedia, a szabad enciklopédia
