Gélelektroforézis (DNS elemzés)

 


A gyakorlat programja (1x10x4):

Időtartam (óra)

Tevékenység

0.5

ZH

0.5

bevezető, eszközök, feladatok ismertetése

1

mintaelőkészítés, gél elkészítése

1.5

mérés, a gél fotózása

1.5

kiértékelés, diszkusszió, jegyzőkönyv elkészítése egyénileg (otthon)

5

 

  1. A gyakorlatvezető bemutatja a módszer elvét, a készülék felépítését, a kiértékelő szoftver működését.
  2. A gyakorlaton DNS fragmenteket (DNS létra standard) határoznak meg agarózgél elektroforézis módszerrel. 1 csoport 1 gélt készít, melyre minden hallgató 1-2 mintát visz fel. Az ismeretlen mintákat (összesen 2) úgy készítjük, hogy 4 µL mintapufferhez (loading dye) 1 µL ismeretlen törzsoldatot mérünk. Minden mintát (DNS létrák és ismeretlen) kétszer viszünk fel a gélre két különböző mintatartó zsebbe. A mintatartó zsebekbe 2 µL mintát kell a mikropipettával bejuttatni. Az elektroforetizáló kád összeszerelése után a gyakorlatvezető segítségével történik a tápegység beállítása és bekapcsolása. Az elektroforézis várhatóan kb. 1 órát vesz igénybe.
  3. 20 perc-es ZH.
  4. Elválasztást követően a DNS-t Dark Reader készülékkel teszik láthatóvá, a gélt lefényképezik.
  5. A gyakorlatvezető útmutatásai szerint a hallgatók önállóan értékelik ki a gyakorlaton kapott eredményeket.

    AMENNYIBEN TÖBBEN UGYANAZT AZ ADATKIÉRTÉKELÉST ADNÁK BE, A LEGJOBB JEGY AMIT A GYAKORLATON ŐK KAPHATNAK: 2.

    A gél lefényképezésekor kapott jpg fájlt szoftveresen kell kiértékelni (a CP-ATLAS gélkiértékelő szoftver letölthető, a használati útmutató itt található. Downloads menüpont, CpAtlas.zip vagy CpAtlas.rar fájl, kicsomagolás után telepítés nélkül futtatható).
  6. Az eredmények értékelésénél az ismeretlen DNS fragmens bázispár számának meghatározásához szerkesszen kalibrációs egyenest Excel programban (bázispárok számának (végsősoron a molekulatömeg) logaritmusa a migrációs távolságok (Rf értékek) függvényében ábrázolva). A diagramon az egyenes egyenletét és az R2 értékét is tüntesse fel. A kapott diagramot ragassza be a jegyzőkönyvébe! A jegyzőkönyvhöz csatolja a gél fényképét (kis méretben!), a kiértékelő szoftverrel készített elektroferogramokat illetve az ezekből nyert adatokat táblázatos formában (pl. print screen módszerrel). Lefényképezheti az elektroforetizáló berendezést, beragaszthatja a jegyzőkönyvébe és elláthatja jelölésekkel, megjegyzésekkel.
  7. A kapott eredményeket, megfigyeléseket megfelelően dokumentálja és értelmezze is azokat. Figyelje meg az elektródoknál tapasztalható gázfejlődés intenzitását, a megfelelő reakciók felírásával magyarázza meg a tapasztaltakat. Diszkutálja, hogy az Rf értékek milyen összefüggésben vannak a DNS fragmensek bázispárjainak számával. Mivel magyarázható, hogy DNS fragmenseket agarózgélen, míg fehérjéket poliakrilamid-gélen választanak el egymástól? Az agarózgél koncentrációjának változtatása hogyan befolyásolja a (kisebb és nagyobb) DNS fragmensek  elválasztását? A különböző koncentrációjú DNS létra minták esetén vizsgálja meg, hogy a csúcs alatti területek és a koncentrációk között megállapítható-e hozzávetőleges lineáris összefüggés.

 

A gyakorlatra való felkészülés során kérjük nézze meg az „Agarózgél készítése”, a „Gélelektroforézis lépései” és a „Mikropipetták használata” című videókat.
A jegyzőkönyveket a D szárny 5. emelet folyosó végén lévő „Gélelektroforézis” feliratú polcra kell berakni.

 

Lehetséges feladatok, kérdések a ZH-ban: 

  1. Az elektroforézis 3 alapvető módszere.
  2. Hogyan készítik az agarózgéleket DNS elemzéshez? 
  3. Hogyan készítik a poliakrilamid-géleket? Milyen elrendezésekben alkalmazhatók?
  4. Ismertesse részletesen a diszk PAGE módszert. 
  5. Az SDS-PAGE eljárás elve és alkalmazási köre. 
  6. Milyen hatása van a hőmérsékletnek, pH-nak, ionerősségnek, térerőnek a gélelektroforetikus elválasztásra? 
  7. Hogyan történik a fehérjék és nukleinsavak detektálása az elektroforetikus elválasztást követően?
  8. Blottolási eljárások főbb jellemzői. 
  9. Nagyhatékonyságú DNS szekvenálási módszerek.

 Ajánlott irodalom:

  • http://www.pbs.org/wgbh/nova/genome/sequencer.html (animáció DNS szekvenálásról)
  • C.D. Harris: Quantitative Chemical Analysis, 7. kiadás, Freeman, 2007
  • G.D.Christian: Analytical Chemistry, 6. kiadás, Wiley, 2004 
  • Gáspár A.: Kapilláris zónaelektroforézis, Egyetemi Kiadó, 2000
  • Wikipedia, a szabad enciklopédia


Oktatási segédanyag (pdf)

Képek az agarózgél készítés menetéről (pdf)
Képek a poliakrilamidgél készítésének menetéről (pdf)

ingyenes kiértékelőszoftver

(zip, kicsomagolás után az exe fájl futtatandó)
(Dr. Lázár István)

Gyakorlaton használt DNS létra (jpg)

 

 

DNS elemzések csoportonként zip fajlban:

 

2019.04.29.:

1. csoport

2. csoport

3. csoport

4. csoport

5. csoport

6. csoport

verbuvált - 5b csoport

2019.04.30.:

7. csoport

8. csoport

9. csoport

10. csoport

11. csoport

12. csoport

13. csoport

14. csoport
 

Animációk, filmek:
Géleletroforézis

Southern blotting

Western blotting1

Western blotting2

SDS-PAGE elektroforézis

DNS szekvenálás

DNS vizsgálat

Agarózgél készítése
Gélelektroforézis lépései

Mikropipetta használata